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función novedosa tanto para JUNB como para su objetivo miR-182 en el desarrollo vascular linfático en el pez cebra.Además, mostramos que miR-182 atenúa la expresión de foxo1, lo que indica que se requieren niveles de Foxo1 estrictamente equilibrados para el desarrollo vascular linfático adecuado en el pez cebra.En conclusión, nuestros hallazgos descubren con el eje regulador Junb/miR-182/Foxo1 un nuevo actor clave en el gobierno de la morfogénesis vascular linfática en el pez cebra.La vasculatura sanguínea y linfática se caracteriza por un alto grado de conservación en vertebrados como humanos, ratones y peces cebra con respecto a la estructura y la función1.Un requisito previo necesario para el correcto desarrollo de los vasos es un control estrictamente equilibrado de la expresión génica2.Hemos informado previamente a través de enfoques de pérdida de función en ratones que el miembro de AP-1 JUNB es un regulador transcripcional crítico de los procesos vasculares.La ablación completa de Junb provoca letalidad embrionaria temprana debido a (i) deterioro de la neoangiogénesis de la decidua, (ii) deterioro de la angiogénesis del laberinto placentario y (iii) falla en la remodelación del plexo vascular primario del saco vitelino3.Además, la anulación de Junb específica de células endoteliales da como resultado un fenotipo similar con embriones retrasados ​​que mueren alrededor de E10 y muestran una vasculatura desorganizada con ramificaciones aberrantes y vasos dilatados4.El trabajo posterior reveló que la función de JUNB en estos procesos está mediada por la activación transcripcional de sus objetivos Vegfa5, Cbfβ y Mmp134 que actúan como reguladores importantes de la angiogénesis en la hipoxia celular.Los genes diana de JUNB identificados hasta ahora implicados en los procesos vasculares y la homeostasis6 están todos, sin excepción, regulados positivamente por JUNB.Sin embargo, JUNB es conocido como un regulador transcripcional dependiente del contexto con funciones reguladoras positivas y negativas7,8.Sin embargo, no se sabe si las funciones reguladoras negativas de JUNB son igualmente necesarias para el desarrollo vascular.Recientemente, se descubrió que los miembros de AP-1 regulan los microARN (miARN), incluidos miR-219, miR-10110, miR-14411, miR-15512 y miR-20313 que inician la descomposición del ARNm o inhiben la traducción de proteínas y, por lo tanto, funcionan como -sintonizadores de la expresión génica.Aunque miR-21 y miR-155 pueden actuar como moduladores de la remodelación de los vasos y la enfermedad vascular14,15,16, estos microARN no se consideran los llamados angiomiR17, un grupo emergente de microARN que está involucrado de manera crítica en las vías de señalización angiogénica in vivo .MiR-126 fue el primer angiomiR que demostró ser necesario para la angiogénesis y la integridad de los vasos tanto en ratones como en peces cebra18,19.Además, los enfoques de eliminación mediada por morfolino en el pez cebra han subrayado la importancia de los micro-ARN para el desarrollo vascular20,21.Hasta ahora, todavía falta un vínculo funcional entre los microARN regulados específicamente por JUNB y el desarrollo vascular.En este estudio, identificamos JUNB y un nuevo microARN dependiente de JUNB, miR-182, como reguladores esenciales para el desarrollo vascular linfático adecuado en el pez cebra.Con el fin de identificar los microARN regulados dependientes de JUNB, sometimos fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)22 de tipo salvaje (wt) y deficientes en Junb (Junb-/-) a un perfil de expresión global de miARN e identificamos miR-182.La expresión de MiR-182 se validó en tres pares distintos de clones Junb-/- y wt MEF mediante un ensayo de miARN Taqman, lo que demuestra que miR-182 se pierde o se reduce de manera constante con la ablación de Junb (Fig. 1a, b).Publicaciones recientes han demostrado que miR-182 es un miembro del grupo de miARN miR-183~96~182 probablemente cotranscrito como un único precursor23.El análisis del patrón de expresión de todo el grupo en MEF reveló que la expresión de los tres miRNA maduros depende estrictamente de JUNB (Fig. 1c).Además, los análisis de expresión en células musculares lisas vasculares primarias (vSMC) y células endoteliales primarias (EC) derivadas de ratones knockout para Junb de control o condicionales (JunbΔ/− Col1α2-cre)24 confirmaron que JUNB es esencial para la expresión completa de miR- El grupo 183 ~ 96 ~ 182 en vSMC (Fig. 1d) y en EC, aunque los niveles de expresión en EC son bastante bajos (datos no mostrados).Para excluir que la expresión alterada de todo el grupo de miARN se deba a un procesamiento aberrante de miARN en ausencia de JUNB, determinamos los niveles de expresión de las transcripciones primarias.Los ensayos Taqman específicos de Pri-miR mostraron que las transcripciones primarias dependían de manera similar de JUNB en comparación con los miARN maduros (Fig. 1e, f), lo que indica que la pérdida de Junb afecta más la transcripción que el procesamiento postranscripcional del grupo de miARN.( a ) La expresión diferencial de miR-182 se identificó mediante el perfil de expresión de miARN de dos pares de clones MEF independientes de tipo salvaje y deficientes en Junb.*limma adjp < 0,05.Para obtener más información, consulte Métodos complementarios.( b ) Validación de la expresión madura de miR-182 en MEF de tipo salvaje (+/+) y deficientes en Junb (-/-) (n = 5) según lo determinado por el ensayo de miARN Taqman.( c, d ) Se realizaron ensayos de miARN Taqman para miR-183, miR-96, miR-182 maduros en tipo salvaje y knockout de Junb ( c ) MEF (n = 5) y ( d ) células de músculo liso vascular (vSMC, n = 3–5).La expresión de miARN maduros se normalizó a ARNsn U6 y se representó en relación con la expresión de miR-182 en células deficientes en Junb.( e, f ) La expresión de las transcripciones primarias de miR-183, -96, -182 se determinó mediante qRT-PCR basada en Taqman específica de pri-miR en Junb knockout versus tipo salvaje ( e ) MEF (n = 4–8) y ( f ) vSMC (n = 3–6).Los niveles de expresión se normalizaron a Hprt y B2m y se representaron en relación con pri-miR-182 en células Junb-knockout.(a–f) Media ± DE.***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, prueba t de Student no apareada.Dado que JUNB es un regulador crítico para la angiogénesis adecuada en ratones3,4,5, nos preguntamos si el miR-182 dependiente de Junb recientemente identificado también es necesario para el desarrollo vascular.Para abordar esta pregunta, elegimos la eliminación mediada por morfolino de junb o miR-182 en embriones de pez cebra.El gen Junb de mamíferos tiene dos ortólogos en el pez cebra, junba y junbb25, que codifican proteínas con una identidad de secuencia del 75,6 %, y ambas transcripciones se expresan a niveles similares con una abundancia creciente de 24 a 96 horas después de la fertilización (hpf; consulte la figura complementaria S1 ).El seguimiento del patrón de expresión de ambos transcritos de junb mediante la hibridación in situ de montaje completo de 30 embriones hpf confirmó los datos publicados previamente26,27, por ejemplo, la alta expresión de junba y junbb en el ojo (consulte la Fig. S1 complementaria).Además, se observaron transcripciones de junba y junbb en el proctodeo/cloaca.Dado que se observó una expresión débil de junbb en el mesodermo y la vasculatura (consulte la Fig. S1 complementaria), analizamos la expresión de junb en EC aisladas mediante clasificación de citómetro de flujo de células positivas para EGFP de embriones de pez cebra 24 hpf Tg (fli1: EGFP) y1 (Fig. .2a).El análisis de qRT-PCR reveló niveles de expresión relativamente altos de junb en la fracción de células negativas para EGFP, muy probablemente debido a la expresión prominente de junb en la retina y el cerebro (consulte la Fig. S1 complementaria).Sin embargo, las transcripciones de junba y junbb se expresaron abundantemente en EC y el nivel de expresión relativo fue incluso más alto que el nivel del marcador kdrl específico de EC (Fig. 2a).Por lo tanto, elegimos la línea informadora de pez cebra Tg (fli1: EGFP) y1 para los enfoques de eliminación y, debido a la falta de intrones en ambos genes junb, inyectamos morfolinos (MO) bloqueadores de ATG contra cada junba individual, junbb y ambos junb. ARNm (ver Fig. S1 complementaria).La caída de basura en el pez cebra provoca fallas en la formación de PL.( a ) Análisis de expresión de ADNc aislado de células clasificadas con EGFP + FAC de embriones Tg (fli1: EGFP) y1 de 24 hpf.Junba y junbb se expresan en EC a niveles similares al marcador de EC kdrl.El fuerte enriquecimiento de kdrl en GFP+ y del marcador neuronal znp-1 en la fracción GFP-, respectivamente, demuestra una clasificación FAC adecuada.Las barras de error indican la media +/- SD (b) Embriones de pez cebra de tipo salvaje co-inyectados con 100 pg de un plásmido informador junba:EGFP o junbb:EGFP linealizado y 2 ng del morfolino experimental o estándar respectivo (std-MO) como se indica se ensayaron para determinar la expresión de EGFP reportero a las 24 hpf.Los embriones inyectados con junb: EGFP-reporter construct y std-MO muestran una fuerte expresión de EGFP, mientras que junba o junbb morpholino bloquearon completamente la señal de EGFP, respectivamente.El panel muestra embriones representativos de cada grupo de inyección.(c) Panel izquierdo, imágenes de campo claro de embriones representativos a 72 hpf inyectados con el morfolino indicado: std-MO (4 ng, n = 104), junba-MO1 (2 ng, n = 115), junbb-MO1 (2 ng, n = 92), junba-MO1 + junbb-MO1 (2 ng + 2 ng, n = 108).Panel central, imágenes confocales de la vasculatura del tronco en la región embrionaria Tg(fli1:EGFP)y1 marcada por un rectángulo a la izquierda.Panel derecho, vista ampliada de la región del tronco marcada por el rectángulo amarillo en el panel central.DA, aorta dorsal;PCV, vena cardinal posterior;ISV, vasos intersegmentarios;PL está marcado con flechas amarillas o, si está ausente, con asteriscos.Los paneles son vista lateral;dorsal arriba, anterior a la izquierda.Las barras de escala representan 500 μm (negro) y 50 μm (blanco).( d, e ) Porcentaje de defectos de PL en embriones que se muestran en ( c ) a 48 y 72 hpf y para un segundo conjunto no superpuesto de MO de bloqueo de traducción específicos de Junb (MO-2).std-MO (n = 58), junba-MO2 + junbb-MO2 (n = 76).La suma de 16 hemisegmentos por embrión se clasificó en grupos sin PL, con ausencia parcial o total.***P < 0,001, prueba U de Mann-Whitney.( e ) Cuantificación de ISV arteriales y venosos (aISV, vISV) dados como % aISV y vISV en embriones de pez cebra Tg (fli1: EGFP) y1 inyectados con morfolinos indicados a 72 hpf.Media ± DE, n = 50-60 embriones/grupo.***P < 0,001, prueba t de Student.En ausencia de anticuerpos disponibles comercialmente validados que puedan detectar y discernir las proteínas Junba y Junbb del pez cebra, optamos por un enfoque alternativo para determinar el grado de eliminación de proteínas para cada parálogo.Creamos construcciones de reportero EGFP en marco que contienen los sitios de unión de morfolino específicos de paralog de Junb (ver Fig. S1 complementaria) y coinyectamos cada MO con la construcción de ADN linealizado correspondiente en embriones de células individuales.Cuando se inyectaron 100 pg de junba-EGFP o junbb-EGFP, la mayoría de los embriones mostraron una fuerte expresión de EGFP a las 24 hpf (datos no mostrados).La coinyección con 2 ng de los morfolinos experimentales junba-MO1/2 con Junba-EGFP o de junbb-MO1/2 con Junbb-EGFP suprimió completamente la expresión de EGFP, mientras que std-MO tuvo poco efecto sobre la expresión del reportero (Fig. 2b) , lo que indica que los MO específicos de Junb evocan una inhibición de la traducción eficiente y específica.Según los datos, usamos 2 ng de cada MO para experimentos adicionales.Los morfantes Junba y Junbb no mostraron ninguna aberración morfológica grave.La formación de los principales vasos en el tronco del pez cebra, como la aorta dorsal (DA), la vena cardinal posterior (PCV), los vasos intersegmentarios (ISV), los linfangioblastos paracordales (PL) y la vena anastomótica longitudinal dorsal (DLAV) se examinó mediante microscopía confocal y se encontró que era normal para los embriones inyectados con un morfolino de control estándar (std-MO, Fig. 2c).Por el contrario, los morfantes inyectados con junba-MO1, junbb-MO1 o la combinación de ambos exhibieron una falta casi completa de linfangioblastos paracordales (PL, Fig. 2c).Otros buques en el tronco del pez cebra, como el DA, PCV, ISV y DLAV, se desarrollaron normalmente y en su mayoría no se modificaron, excepto por algunas ligeras variaciones individuales.A las 48 hpf, el PL estaba completamente ausente en el 77 %, el 91 % y el 94 % de los morfantes inyectados con junba-MO1, junbb-MO1 o ambos, respectivamente, frente al 22 % de los embriones de control (Fig. 2d, panel izquierdo).A las 72 hpf, la formación del PL debería estar completa26.En ese momento, el 82% de los embriones de control investigados mostraron un PL completo, el 55% y el 53% de los morfantes individuales junba y junbb, respectivamente, pero solo el 16% de los morfantes dobles junb exhibieron un PL completo (Fig. 2d, panel derecho).Los datos obtenidos con un segundo conjunto no superpuesto de MO específicos de junb (MO2; consulte la Fig. S1 complementaria) dieron resultados idénticos (Fig. 2e).A las 72 hpf, nuevamente solo el 13% de los morphants dobles de junb inyectados con junba-MO2 y junbb-MO2 desarrollaron un PL completo (Fig. 2e, panel inferior).Con el fin de excluir que los defectos en la formación de PL sean secundarios a una circulación sanguínea interrumpida eventualmente debido a una insuficiencia cardíaca, monitoreamos el corazón latiendo de 48 embriones hpf (ver Videos complementarios 1 a 4), el flujo sanguíneo y la distribución de arterial y vasos intersegmentarios venosos en la región del tronco de 72 embriones hpf (ver videos complementarios 5 a 8).El análisis de video reveló que en los morphants dobles de Junb similares a los morphants de control, el corazón parecía normal y las células sanguíneas viajaban constantemente a través de la red vascular en el tronco (ver Videos complementarios 1 a 8).El análisis cuantitativo de la identidad arterial-venosa de los vasos intersegmentarios obtuvo una proporción de aISV a vISVS de 48: 52% para los morfantes inyectados con un morfolino estándar (Fig. 2f).En los morfantes dobles de Junb, esta proporción se desplazó ligeramente hacia 43:57% a favor de las venas (Fig. 2f).En resumen, aunque los morfantes dobles de Junb muestran un ligero aumento en el número de ISV venosos, carecen de defectos evidentes en la circulación sanguínea, lo que podría interferir con la formación de PL.Para verificar aún más si la pérdida de Junb causa una falla en el desarrollo de los vasos linfáticos en el pez cebra, utilizamos un enfoque de genética inversa aplicando la tecnología CRISPR/Cas9.Generamos ARN guía (ARNg) CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) para apuntar individualmente al ADN genómico de junba y junbb de pez cebra (consulte la Fig. S2 complementaria).El ensayo de endonucleasa I T7 y los análisis de fusión de alta resolución (HRM) demostraron que los gRNA CRISPR de junb fueron altamente eficientes para mutar específicamente los dos loci de junb, ya que entre seis y ocho de los ocho embriones seleccionados al azar portaban mutaciones (consulte la Fig. S2 complementaria).La inyección de ARNg de CRISPR junto con el ARNm de Cas9 no afectó la morfología embrionaria general ni la formación de vasos sanguíneos, pero provocó una falla específica en el desarrollo de los vasos linfáticos como se observó en los morphants de Junb (Fig. 3).A las 48 hpf, el PL estaba completamente ausente en el 94 % y el 100 % de los embriones inyectados con ARNg de junba y CRISPR en comparación con el 35 % de los embriones inyectados con ARNg de CRISPR de control o sin tratar (Fig. 3b, panel izquierdo).A las 72 hpf, el 78 % de los embriones no inyectados y el 84 % de los embriones inyectados con ARNg CRISPR de control formaron una PL completa.Por el contrario, solo el 30 % y el 60 % de los embriones inyectados con ARNg de junba y junbb-CRISPR, respectivamente, mostraron un PL intacto (Fig. 3b, panel derecho).Para probar, si la eliminación combinada de ambos parálogos de Junb mejoraba aún más el fenotipo, multiplexamos los ARN guía CRISPR para junba y junbb y descubrimos que el 67% de los embriones inyectados con ARNg doble de junba y junbb-CRISPR no lograron desarrollar un PL intacto (Fig. 3b, panel derecho) por 72 hpf.La cuantificación de los aISV frente a los vISV reveló una proporción de arterias a venas de 52:48 % para los embriones inyectados con un CRISPR de control (Fig. 3C).La proporción de aISV:vISV en embriones inyectados con ARNg de junba y junbb-CRISPR fue del 55:45 % (Fig. 3c).Sin embargo, la comparación del porcentaje de vISV de embriones inyectados con CRISPR de control frente a vISV de embriones inyectados con ARNg de junba y junbb-CRISPR no reveló diferencias significativas.En resumen, observamos una alta correlación entre los fenotipos de los embriones inyectados con ARNg CRISPR y los morphants de Junb con respecto al desarrollo de vasos linfáticos.Junb knockout en fenocopias de pez cebra el fenotipo PL de Junb knockdown mediado por MO.(a) Panel izquierdo: imágenes de campo brillante de embriones representativos a 72 hpf inyectados con el gRNA CRISPR indicado: co-CRISPR (400 pg), junba-CRISPR (250 pg), junbb-CRISPR (250 pg), junba-CRISPR + junbb-CRISPR (200 pg + 200 pg).Panel central: imágenes confocales de la vasculatura del tronco en la región embrionaria Tg(fli1:EGFP)y1 marcada con un rectángulo a la izquierda.Panel derecho, vista ampliada de la región del tronco marcada por el rectángulo amarillo en el panel central.DA, aorta dorsal;PCV, vena cardinal posterior;ISV, vasos intersegmentarios;PL marcado con flechas amarillas o, en su defecto, con asteriscos.Los paneles son vista lateral;dorsal arriba, anterior a la izquierda.Las barras de escala representan 500 μm (negro) y 50 μm (blanco).(b) Porcentaje de defectos de PL en embriones (a 48 y 72 hpf) inyectados con gRNA CRISPR como se describe en (a) contra junba (n = 68), junbb (n = 94) o en combinación contra ambos (n = 150 ) frente a embriones inyectados con CRISPR de control a las dosis correspondientes de 250 pg (n = 99) o 400 pg (co-CRISPR, n = 105).La suma de 16 hemisegmentos por embrión se clasificó en grupos sin PL, con ausencia parcial o total.***P < 0,001, prueba U de Mann-Whitney.( c ) Cuantificación de ISV arteriales y venosos (aISV, vISV) dados como % aISV y vISV en embriones de pez cebra Tg (fli1: EGFP) y1 a 72 hpf inyectados con gRNA CRISPR indicados.n = 40 embriones/grupo, media ± DE.**P < 0,01, ns, no significativo, prueba t de Student.Para investigar si el miR-182 actúa funcionalmente aguas abajo de Junb en el pez cebra, silenciamos el miR-182 en el pez cebra transgénico Tg(fli1:EGFP)y1 y usamos, además del morfolino estándar, un miR-182-MO con 5 desajustes (miR -182-5MM-MO, Fig. 4a) como control de especificidad.La inyección de 12 ng de miR-182-MO provocó una reducción del 80 % de los niveles de miR-182 en comparación con los morphants inyectados con std-MO (Fig. 4b), pero no dio lugar a efectos secundarios inespecíficos a juzgar por la morfología general del pez cebra ( Fig. 4c-e).La microscopía confocal reveló una formación normal de DA, PCV e ISV (Fig. 4d), así como una proporción normal de aISV: vISV con 48: 52% (Fig. 4c).Sorprendentemente, el silenciamiento de miR-182 imitó la doble caída de junb con respecto al fenotipo PL tanto en la ocurrencia temporal como en la fuerza de los defectos (Fig. 4d, e).A las 48 hpf, el 88 % de los embriones exhibió una falta completa de PL tras la inyección de miR-182-MO frente al 3 % de los controles.(Fig. 4e, panel izquierdo) Como el PL estuvo ausente en solo el 23% de los embriones inyectados con miR-182-5MM-MO y como este defecto en los morfantes miR-182-5MM se compensó durante el desarrollo, se puede observar un efecto fuera del objetivo. excluido.A las 72 hpf, un PL completo y parcial estaba presente en el 90% de los morfantes miR-182-5MM en comparación con el 100% en los morfantes de control inyectados con un std-MO no relacionado (Fig. 4e, panel derecho).Por el contrario, solo el 46% de los morfantes miR-182 pudieron desarrollar al menos un PL parcial.En conjunto, la eliminación de miR-182 produce un fenotipo vascular linfático similar a la pérdida de junb en el pez cebra con un efecto específico y sorprendente en la formación de PL.El silenciamiento de la expresión de miR-182 recapitula el fenotipo PL de eliminación de Junb.( a ) Secuencias de la hebra guía de pre-miR-182 objetivo y de miR-182 (miR-182-MO) y morfolinos de control de 5 desajustes (miR-182-5MM-MO) utilizados.Los nucleótidos de miR-182 maduro y los nucleótidos sustituidos de miR-182-5MM-MO están marcados en negrita y rojo, respectivamente.(b) Eliminación de miR-182 dependiente de la dosis según lo determinado por el ensayo de miARN Taqman en embriones de pez cebra de 48 hpf después de la inyección de miR-182-MO, std-MO o miR-182-5MM-MO utilizando las concentraciones de MO indicadas.Los datos se normalizan a U6 snRNA y se expresan como media ± SEM (n = 3).***P < 0,001, **P < 0,01, prueba t de Student no pareada para comparación con miR-182-5MM-MO.(c) Cuantificación de ISV arteriales y venosos (aISV, vISV) dados como % aISV y vISV en embriones de pez cebra Tg(fli1:EGFP)y1 inyectados con morfolinos indicados a 72 hpf dados como % aISV y % vISV.Media ± DE.ns, no significativo, prueba t de Student.(d) Panel izquierdo, imágenes representativas de campo claro de embriones de pez cebra de 72 hpf inyectados con miR-182-MO (12 ng, n = 151) en comparación con std-MO (12 ng, n = 107) y miR-182-5MM- MO (12 ng, n = 139).Panel central, imágenes confocales de la vasculatura del tronco en la región embrionaria respectiva marcada por un rectángulo a la izquierda.Panel derecho, vista ampliada de la región del tronco marcada por el rectángulo amarillo en el panel central.DA, aorta dorsal, PCV, vena cardinal posterior y ISV, vasos intersegmentarios.PL está marcado con flechas amarillas o, si está ausente, con asteriscos.Los paneles son vista lateral;dorsal arriba, anterior a la izquierda.Barras de escala: 500 μm (negro) y 50 μm (blanco).( e ) Porcentaje de defectos de PL en embriones a 48 hpf y 72 hpf.***P < 0,001, prueba U de Mann-Whitney.A continuación, examinamos si los fenotipos causados ​​por el silenciamiento de Junb pueden rescatarse mediante la sobreexpresión de miR-182.Para este propósito, co-inyectamos un miR-182 de doble cadena (182-Mimic) o un oligonucleótido de control negativo (Neg-Mimic) en junba + junbb dobles morfantes generados por dos conjuntos independientes de OM específicos de junba y junbb ( MO1 y MO2).Se estableció la concentración mímica óptima y se validó la sobreexpresión de miR-182 mediante el ensayo de miARN Taqman (consulte la Fig. S3 complementaria).La inyección única de Neg-Mimic o 182-Mimic en sí no provocó un fenotipo aparente (ver la Fig. S3 complementaria).De manera similar, la inyección conjunta de Neg-Mimic no alteró significativamente la penetrancia del fenotipo PL en los morfantes dobles junba / junbb (Fig. 5a, b).Lo que es más importante, la coaplicación de 182-Mimic en los morfantes dobles junba/junbb restauró sustancialmente la formación de PL del 11 % al 75 % (MO1) o del 0 % al 53 % (MO2) de embriones con PL completa y parcial como cuantificado a 48 hpf (Fig. 5b, panel izquierdo).A las 72 hpf, la administración ectópica de miR-182 restauró el PL en junba/junbb morfantes dobles de tal manera que ahora el 67 % (MO1) y el 60 % (MO2) de los embriones mostraban un PL completamente intacto en comparación con el 11 % y el 10 % de junba/junbb Embriones eliminados -MO1 y -MO2, respectivamente (Fig. 5b, c).Por lo tanto, los datos obtenidos con un segundo conjunto independiente de MO específicos de junb (MO2) dieron resultados casi idénticos.Estos hallazgos indican que miR-182 actúa aguas abajo de Junb y sugieren fuertemente que Junb y miR-182 actúan en una vía de señalización común crucial para la morfogénesis vascular linfática en el pez cebra.MiR-182 ectópico restaura la formación de PL en morphants Junb.(a) Panel izquierdo, imágenes de campo brillante que muestran la morfología general de junba y junbb (2 + 2 ng) morfantes dobles inyectados con o sin Neg-Mimic (40 pg, n = 127) o 182-Mimic (40 pg, n = 109 ).Panel central: Imágenes confocales de la región del tronco indicada en embriones Tg(fli1:EGFP)y1 a 72 hpf.Panel derecho, vista ampliada de la región del tronco marcada por el rectángulo amarillo en el panel central.DA, aorta dorsal, PCV, vena cardinal posterior y ISV, vasos intersegmentarios.PL está marcado con flechas amarillas o, si está ausente, con asteriscos.Los paneles son vista lateral;dorsal arriba, anterior a la izquierda.Barras de escala: 500 μm (negro);50 micras (blanco).(b) Porcentaje de embriones inyectados con MO y Mimics como se indica y (c) para un segundo conjunto de junb-MO: junba-MO2 + junbb-MO2 (2 ng + 2 ng, n = 112), con o sin Neg- Mimic (40 pg, n = 145) o 182-Mimic (40 pg, n = 119).***P < 0,001, prueba U de Mann-Whitney.Aunque analizamos la formación de PL a las 72 hpf, un momento en el que la formación de PL debe completarse28, también investigamos la formación del conducto torácico (TD) a los 5 dpf para excluir que el fenotipo de PL simplemente sea causado por un retraso en el desarrollo. .En las larvas de pez cebra de control, inyectadas con un std-MO o un miR-182-5MM-MO, el TD se formó en el 93% de las larvas por 5 dpf como un vaso linfático continuo (Fig. 6a, b).Por el contrario, solo el 17 % de los morfantes dobles junba/junbb y el 11 % de las larvas de pez cebra con expresión silenciada de miR-182 desarrollaron una TD continua en 5 dpf, respectivamente (Fig. 6a, b).Estos datos indican que el desarrollo del sistema vascular linfático no se retrasó sino que se abortó por completo tras la eliminación de Junb o miR-182.En línea con nuestro enfoque de rescate anterior, la expresión ectópica de 182-Mimic en junba / junbb-MO1 doble morfantes restauró por completo la formación de TD por 5 dpf en el 73% de las larvas (Fig. 6a, b), que podría recapitular con un segundo conjunto de MO de Junb (Fig. 6c), que respalda el concepto de que miR-182 es un objetivo de Junb requerido para la morfogénesis vascular linfática en el pez cebra.Es importante destacar que las larvas inyectadas con ARNg de junba y junbb-CRISPR tampoco logran formar un TD intacto.Mientras que alrededor del 80 % de las larvas inyectadas con gRNA CRISPR de control desarrollaron una TD continua a los 5 dpf, solo el 4 % y el 7 % de las larvas inyectadas con gRNA CRISPR junba y junbb, respectivamente, mostraron una TD intacta.Además, la inyección combinada de gRNA junba- y junbb-CRISPR mejoró aún más el fenotipo, lo que resultó en que el 97% de las larvas carecían de un TD intacto (Fig. 6d).El fallo en la formación de TD de los morfantes Junb se restaura mediante miR-182 ectópico.(a) Panel izquierdo, imágenes confocales de la vasculatura del tronco de larvas representativas a los 5 dpf inyectadas con el morfolino o imitador indicado: std-MO (4 ng, n = 62), junba-MO1 + junbb-MO1 (2 ng + 2 ng, n = 60), miR-182-5MM-MO (12 ng, n = 59), miR-182-MO (12 ng, n = 60), junba-MO1 + junbb-MO1 + 182-Mimic (2 ng + 2 ng + 40 pg, n = 32).Panel central, imágenes confocales de la región del tronco indicada.Panel derecho, vista ampliada de la región del tronco marcada por un rectángulo amarillo en el panel central.TD está ubicado entre la aorta dorsal (DA) y la vena cardinal posterior (PCV) y está marcado con flechas amarillas o, si no está presente, con asteriscos.Los paneles son vista lateral;dorsal arriba, anterior a la izquierda.Barra de escala blanca: 50 μm.( b, c ) Porcentaje de defectos de TD en larvas para el primer ( b ) y el segundo conjunto de junb-MO ( c ).(d) Panel izquierdo, imágenes confocales de la vasculatura del tronco de larvas representativas a 5 dpf CRISPR gRNA inyectado con gRNA junb-CRISPR indicado o control CRISPR gRNA: junba-CRISPR (250 pg gRNA), junbb-CRISPR (250 pg gRNA) , junba-CRISPR + junbb-CRISPR (200 pg + 200 pg gRNA) y Co-CRISPR (400 pg gRNA).Etiquetado y barra de tallas como se describe en (a).( e ) Porcentaje de defectos de TD en larvas a los 5 dpf inyectadas con gRNA CRISPR contra junba, junbb o una combinación de ambos versus larvas inyectadas con gRNA CRISPR de control.La suma de 10 segmentos de somita por embrión se categorizó en grupos con presencia, ausencia parcial o total de DT.***P < 0,001, prueba U de Mann-Whitney.Dado que la pérdida de miR-182 está afectando la formación adecuada de PL y TD (Figs. 4 y 6), planteamos la hipótesis de que la sobreexpresión de un objetivo potencial de miR-182 está causando las malformaciones vasculares linfáticas observadas.Algunos reguladores conocidos de la formación de PL, incluidos Cortactin29, Elmo130 y Netrin 1a31,32, podrían ser el objetivo de miR-182 según el software de predicción de objetivos in silico.Sin embargo, solo el silenciamiento de esos objetivos dificulta la formación de PL, mientras que su sobreexpresión no tiene impacto29,30,31,32.Curiosamente, el factor de transcripción Foxo1 se validó recientemente como un objetivo de miR-182 en el pez cebra implicado en la proliferación y diferenciación de osteoblastos33.Además, Foxo1 actúa como un regulador negativo de la angiogénesis al interferir con la migración, el brote y la formación de tubos de las células endoteliales34.En apoyo de la suposición de que foxo1 es un objetivo importante aguas abajo de Junb y miR-182, identificamos niveles significativamente mayores de ARNm de foxo1 en MEF deficientes en junb (Fig. 7a).Como prueba de nuestra hipótesis de que se requiere el silenciamiento de foxo1 mediado por miR-182 para la formación normal de PL en el pez cebra, nuestro objetivo fue co-inyectar morfolinos foxo1 en morfantes miR-182 para rescatar el fenotipo de los morfantes miR-182.El pez cebra tiene dos para-logs foxo1: foxo1a y foxo1b.Para derribar foxo1a, usamos un morfolino que bloquea el sitio de empalme del intrón 2-exón 3 de foxo1a generando un producto de empalme con omisión de exón denominado sp foxo1a (Fig. 7b y ver la Fig. S4 complementaria).Foxo1b se silenció usando un morfolino de bloqueo de empalme dirigido al sitio de empalme del intrón 1 del exón 1 y, por lo tanto, aboliendo cualquier transcripción madura de foxo1b (Fig. 7b y ver la Fig. S4 complementaria).Dado que los embriones de pez cebra inyectados con 4 ng de morfolino ya presentaban alteraciones morfológicas menores (datos no mostrados), los experimentos posteriores se realizaron con 2 ng de foxo1a- o foxo1b-MO.El silenciamiento de foxo1a o foxo1b no influyó en la expresión de miR-182, ni en la formación de ISV y DLAV (Fig. 4B complementaria), pero de acuerdo con hallazgos previos en Xenopus laevis35 causó un retraso leve en el desarrollo con una falta inicial de formación de PL a las 48 hpf (Fig. 7C, Fig. 4 complementaria).Curiosamente, la formación de PL en los morfantes foxo1 se recuperó a las 72 hpf y ya no fue significativamente diferente de los morfantes de control (Fig. 7C, Fig. 4 complementaria).Sin embargo, el silenciamiento combinado de foxo1a y foxo1b resultó en un deterioro de la formación de PL con solo el 40% de los morfantes mostrando un PL intacto a las 72 hpf (Figura complementaria S4).Por lo tanto, intentamos rescatar la falla de PL en embriones morfantes miR-182 mediante la inyección conjunta de una dosis submáxima de foxo1a- o foxo1b-MO.Es importante destacar que el silenciamiento conjunto de cualquiera de los parálogos de foxo1 en los morfantes miR-182 redujo la penetración de la falla de PL a 72 hpf del 77 % anterior al 29 % o al 37 % cuando se suprimió foxo1a o foxo1b, respectivamente (Fig. 7c) .La frecuencia de fracaso de PL de los embriones co-inyectados con miR-182-5MM-MO y foxo1a- o foxo1b-MO fue del 9 % y aproximadamente similar a la de los embriones inyectados con std-MO.Estos hallazgos indican que foxo1 es uno de los principales objetivos aguas abajo de miR-182 y que se requieren niveles de Foxo1 estrictamente equilibrados para una morfogénesis vascular linfática adecuada en el pez cebra (Fig. 7d).La caída de Foxo1 rescata la falla de formación de PL de los morfantes miR-182.( a ) El análisis de expresión por qRT-PCR reveló una correlación inversa de foxo1 con la expresión de miR-182 en MEF de tipo salvaje frente a MEF deficientes en Junb.Media ± DE (n = 3).*P < 0,05, prueba t de Student para datos no apareados.(b) RT-PCR de embriones de pez cebra inyectados con foxo1a-MO, foxo1b-MO y std-MO (2 ng y 4 ng) a 48 hpf detectando las transcripciones wt foxo1 de embriones inyectados con std-MO, una transcripción foxo1a más grande (sp foxo1a) tras la inyección del foxo1a-MO con omisión de exón y ningún transcrito de foxo1b tras la inyección de su MO específico.Para obtener más información, consulte la figura complementaria S4.Los datos representan los resultados de uno de cuatro experimentos independientes con resultados similares.Actb1 sirvió como control de carga.( c ) Porcentaje de formación de PL a 48 hpf y 72 hpf en embriones inyectados con MO como se indica.n = 82 (12 ng miR-182-MO), n = 248 (12 ng miR-182-MO + 2 ng foxo1a-MO), n = 118 (12 ng miR-182-5MM-MO + 2 ng foxo1a- MO), n = 163 (12 ng miR-182-MO + 2 ng foxo1b-MO), n = 103 (12 ng miR-182-5MM-MO + 2 ng foxo1b-MO).n = 181 (14 ng estándar-MO), n = 77 (12 ng miR-182-5MM-MO).***P < 0,001, *P < 0,05, prueba U de Mann-Whitney.( d ) Esquema para un nuevo eje regulador en la linfangiogénesis del desarrollo en el pez cebra.cienciaNat.Rev Mol.Biol celular.J. Clin.Invertir.J. ciencia celular.J. Mol.Ácidos Nucleicos Res.químicaquímicaZheng, L. et al.BioquímicaBiografía.Res.comúnZhou, J. et al.En t.J. Mol.Medicina.actualOpiniónGineta.desarrollodesarrolloWang, S. et al.desarrolloquímicaquímicadesarrolloJ. ciencia celular.Nat.Medicina.Lu, X. et al.J. Minero de huesos.Res.J. Clin.Invertir.desarrolloNat.Biografía.Zhang, Y. et al.oncol.desarrolloactualNat.Gineta.Tararear.mol.Gineta.desarrolloGenes Evol.FEBS Lett.Nat.Biol celular.mol.Célula.J. Biomédica.cienciaquímicadesarrolloDin.desarrollodesarrolloDin.Activación de p53 por tecnologías knockdown.PLoS Genet.Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.Este trabajo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0.Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt